煙草(Nicotiana tabacum L.)是常用植物組培材料，組培存活率高，周期較短。中學(xué)植物組培實驗一直以來存在實驗工作繁重、整體實驗時間長等問題，培養(yǎng)基的配制繁瑣是重要原因之一。目前，科學(xué)家對簡化培養(yǎng)基配方已進(jìn)行了相關(guān)研究，本實驗一方面通過減少煙草組培MS培養(yǎng)基成分探究培養(yǎng)基中的可去除營養(yǎng)成分;另一方面使用馬鈴薯替代MS培養(yǎng)基中各種成分，通過觀察煙草誘導(dǎo)分化現(xiàn)象是否滿足中學(xué)教學(xué)需求，篩選出適合教學(xué)的簡化培養(yǎng)基配方，達(dá)到節(jié)約人力成本和提高實驗效率的目的。

  1 材料與方法

  1.1 材料 煙草由華南師范大學(xué)生科院細(xì)胞工程實驗室提供;馬鈴薯(Solanum tuberosum)由市場購得。

  1.2 煙草葉片組培培養(yǎng)基篩選 選取生長良好的嫩綠煙草葉片洗凈，在已消毒的工作臺下用75%酒精浸泡30s，接著在濃度為5%的次氯酸鈉溶液浸泡9min，無菌水沖洗并切塊，接入以下培養(yǎng)基中：

  CK. MS培養(yǎng)基+6-BA1.0+NAA0.5(對照組);B. MS培養(yǎng)基-微量元素+6-BA1.0+NAA0.5;C. MS培養(yǎng)基-有機成分+6-BA1.0+NAA0.5;D. MS培養(yǎng)基-微量元素-有機成分+6-BA1.0+NAA0.5;E. MS培養(yǎng)基-微量元素-有機成分+6-BA1.0+NAA0.5+200g/L馬鈴薯溶液;F. MS培養(yǎng)基-大量元素-有機成分+6-BA1.0+NAA0.5+200g/L馬鈴薯溶液;G. MS培養(yǎng)基-大量元素-有機成分-微量元素+6-BA1.0+NAA0.5+200g/L馬鈴薯溶液;H. 200g/L馬鈴薯溶液。

  每個處理組5瓶，2次重復(fù)實驗，置于培養(yǎng)架上培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為室溫;光照強度為25～28μmol/m2·s;光照時間為12 h/d。 接種1～18d觀察污染情況;7～45d觀察外植體生長情況;25d統(tǒng)計誘導(dǎo)所需時間及芽的分化率;35d統(tǒng)計葉的分化率及根的分化率。

  1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理 污染率和芽、葉、根的分化率用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較(Duncan’s method，0.05)。接種培養(yǎng)的煙草葉片，每3d觀察一次，設(shè)置6個指標(biāo)：

  污染率(%)=污染瓶數(shù)/總接種瓶數(shù)×100;壞死率(%)=褐化外植體數(shù)/除去污染的總外植體數(shù)×100;愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/除去污染的總外植體數(shù)×100; 芽的分化率(%)=分化芽的外植體數(shù)/除去污染的總外植體數(shù)×100; 葉的分化率(%)=分化葉的外植體數(shù)/除去污染的總外植體數(shù)×100; 根的分化率(%)=分化根的外植體數(shù)/除去污染的總外植體數(shù)×100。

  2 結(jié)果與分析

  2.1 煙草葉片在缺素MS培養(yǎng)基中的生長狀況 如表1所示，比較對照組(MS培養(yǎng)基+6-BA1.0+NAA0.5)和B、C、D四種培養(yǎng)基，將煙草組織培養(yǎng)生長情況從良好到較差進(jìn)行排序：對照組> B(缺有機成分)> C(缺微量元素)> D(缺有機成分和微量元素)。對比各項指標(biāo)發(fā)現(xiàn)：MS培養(yǎng)基中有機成分對煙草誘導(dǎo)、分化影響不明顯，在一定程度上延遲根的分化。MS培養(yǎng)基中的微量元素對煙草誘導(dǎo)、芽的分化影響不明顯，對煙草葉、根的分化具有重要作用。同時缺乏微量元素和有機成分的MS培養(yǎng)基已經(jīng)無法保證煙草組培的正常進(jìn)行。考慮中學(xué)生物學(xué)教學(xué)節(jié)約成本和簡化步驟的需求，可以采用缺有機成分的F配方代替MS培養(yǎng)基進(jìn)行實驗教學(xué)。

  2.2 煙草葉片在馬鈴薯替代的缺素MS培養(yǎng)基中的生長狀況 如表1所示，對比B-H可以發(fā)現(xiàn)相同缺素條件下，添加馬鈴薯汁的培養(yǎng)基能改善煙草葉片的生長狀況。對比對照組(MS培養(yǎng)基+6-BA1.0+NAA0.5)和四種添加馬鈴薯汁的缺有機成分MS培養(yǎng)基E、F、G、H，將煙草組織培養(yǎng)生長情況從良好到較差進(jìn)行排序：對照組≥ E(馬鈴薯汁代替微量元素)> F(馬鈴薯代替大量元素)= G(馬鈴薯代替大量元素和微量元素)> H(馬鈴薯培養(yǎng)基)。馬鈴薯汁替代微量元素?zé)煵萁M培生長良好，替代大量元素和微量元素能觀察到煙草外植體脫分化、分化出芽、葉和根的現(xiàn)象，但組培苗矮小?？紤]到中學(xué)教學(xué)目標(biāo)在于學(xué)生動手實驗，能夠明顯觀察到植物組培誘導(dǎo)、分化情況即可，CK中培養(yǎng)基中G(馬鈴薯代替大量元素和微量元素)配制時間短，效率高，且基本滿足教學(xué)需求。原本需要100min才能配制完成的MS培養(yǎng)基，G僅需30min。

  表1 不同培養(yǎng)基對煙草組培生長的影響

  3 討論

  簡化培養(yǎng)基的研究目的在于提高培養(yǎng)基配制效率。國內(nèi)外學(xué)者的研究表明, 馬鈴薯、菊花等可以使用白糖、自來水代替蔗糖和蒸餾水，對組培效果影響不明顯。本實驗MS培養(yǎng)基配制使用自來水和蔗糖，結(jié)果表明有機成分對煙草組培影響不明顯，但未發(fā)現(xiàn)其對降低污染率有明顯效果。馬鈴薯培養(yǎng)基在微生物培養(yǎng)中十分常見，但在植物組織培養(yǎng)并未被廣泛接受。因為相比促進(jìn)外植體誘導(dǎo)分化，其對微生物生長更加有利，容易提高污染率而導(dǎo)致實驗失敗。所以，關(guān)于馬鈴薯作為植物組培簡化培養(yǎng)基的研究較少。馬鈴薯的營養(yǎng)成分涵蓋大量元素的所有種類和微量元素的部分種類(除I、B、Mo)。本實驗中馬鈴薯代替微量元素的培養(yǎng)基中外植體愈傷組織、芽、葉均為淺綠色。雖然馬鈴薯中營養(yǎng)成分種類涵蓋范圍廣，但含量與MS培養(yǎng)基含量有差異，不能達(dá)到完全替代的效果。但能保證在教學(xué)周期內(nèi)實驗成功完成，觀察到外植體正常誘導(dǎo)出愈傷組織，分化出芽、葉和根的現(xiàn)象。

  優(yōu)化實驗條件之后的煙草離體培養(yǎng)實驗，滿足課程大綱對中學(xué)組培實驗教學(xué)“掌握培養(yǎng)基的配制、外植體消毒、接種、培養(yǎng)等基本操作技術(shù)”的實驗要求，且未對教學(xué)內(nèi)容產(chǎn)生影響。同時，結(jié)合本實驗對煙草組培單一配方的篩選結(jié)果，可以使用200g/L馬鈴薯代替MS培養(yǎng)基中的大量元素和微量元素制備煙草組培簡化培養(yǎng)基。而該簡化培養(yǎng)基使得原本需要配制100min的MS培養(yǎng)基在30min內(nèi)完成，可大大降低前期準(zhǔn)備的工作量，提高組培實驗的教學(xué)效率，減少組培所需時間和降低人力成本。