組培生產(chǎn)的要點(diǎn)

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在植物組織培養(yǎng)過程中，配制培養(yǎng)基是日常必備工作。為減少工作量，經(jīng)常使用的培養(yǎng)基，可先將各種藥品配成濃縮一定倍數(shù)的母液，放入冰箱內(nèi)保存，用時(shí)再按比例稀釋，這樣操作比較方便，且精確度高...

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詳細(xì)介紹

培養(yǎng)基的配制

母液的配制和保存
在植物組織培養(yǎng)過程中，配制培養(yǎng)基是日常必備工作。為減少工作量，經(jīng)常使用的培養(yǎng)基，可先將各種藥品配成濃縮一定倍數(shù)的母液，放入冰箱內(nèi)保存，用時(shí)再按比例稀釋，這樣操作比較方便，且精確度高。母液要根據(jù)藥劑的化學(xué)性質(zhì)分別配制，一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物質(zhì)等母液。
在配制大量元素母液時(shí)，要防止在混合各種鹽類時(shí)產(chǎn)生沉淀，為此各種藥品必須在充分溶解后才能混合。在混合時(shí)要注意加入的先后順序，把Ca2+、Mn2+、Ba2+、SO42-、PO43-錯(cuò)開，以免KH2PO4和MgSO4與CaCl2等發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，相互結(jié)合生成CaSO4、BaSO4、Ca3(PO4)2沉淀。另外在混合各種無機(jī)鹽時(shí)，其稀釋度要大，慢慢混合，同時(shí)邊混合邊攪拌。在配制微量元素母液時(shí)也要注意藥品的添加順序，以免產(chǎn)生沉淀。

鐵鹽容易發(fā)生沉淀，需要單獨(dú)配制。一般用FeSO4·7H2O和Na2-EDTA配成鐵鹽螯合劑比較穩(wěn)定，不易沉淀，鐵鹽放在棕色瓶中保存比較穩(wěn)定。
母液要用蒸餾水配制，藥品應(yīng)選用純度較高的化學(xué)純CP或分析純AR，以免有雜質(zhì)對(duì)培養(yǎng)物造成不利影響。藥品的稱量及定容都要準(zhǔn)確，稱量不同的化學(xué)藥品需使用不同的藥勺，避免藥品的交叉污染和混雜。每稱好一種藥劑應(yīng)立即作一記號(hào)，以免重復(fù)或遺漏。各種藥品先用少量水讓其充分溶解，然后依次混合。
配制好的母液應(yīng)分別貼上標(biāo)簽，注明母液種類、倍數(shù)、配制時(shí)間，并在記錄本上詳細(xì)記載配制及稱取量，以便工作的準(zhǔn)確及日后檢查。母液最好在2-4℃的冰箱中保存，特別是有機(jī)物質(zhì)要求更嚴(yán)，儲(chǔ)存時(shí)間不宜過長，如發(fā)現(xiàn)母液有霉菌污染或沉淀變質(zhì)時(shí)，應(yīng)重新配制。

多數(shù)植物生長調(diào)節(jié)劑不溶于水或難溶于水，IAA、NAA、IBA、2，4-D等生長素類和GA3，可先用少量0.1molNaOH或95%酒精溶解，然后再用蒸餾水定容到所需要的體積。KT、6-BA等細(xì)胞分裂素類則可用少量1mol/L HCl加熱溶解，然后加水定容。植物生長調(diào)節(jié)劑母液可以在2-4℃的冰箱中保存。配制好的植物生長調(diào)節(jié)劑母液，也應(yīng)在瓶上貼上標(biāo)簽，注明名稱、濃度、配制日期，以便配制培養(yǎng)基時(shí)計(jì)算，準(zhǔn)確量取。
培養(yǎng)基的制取
將配制好的各種母液按順序排列，并逐一檢查是否有沉淀或變色，避免使用已失效的母液。先取適量的蒸餾水放入容器內(nèi)，然后依次用移液管按培養(yǎng)基配方要求量吸取預(yù)先配制好的各種母液及生長調(diào)節(jié)劑，并混合在一起。再將瓊脂粉和糖加入其中，溶解混勻后加蒸餾水定容至所需體積。用0.1mol/L NaOH或HCl將培養(yǎng)基的pH值調(diào)至所需的數(shù)值，然后分裝到培養(yǎng)容器中。根據(jù)材料的不同，裝入培養(yǎng)基的量稍有差別，一般培養(yǎng)裝入0.7~1.2cm高度，讓培養(yǎng)材料能保持原有的狀態(tài)即可，最后包扎好瓶口或蓋上瓶蓋；并對(duì)不同配方的培養(yǎng)基要做好標(biāo)記，以免混淆。

培養(yǎng)基的pH值是影響植物組織培養(yǎng)成功的因素之一。不同種類的植物，其生長發(fā)育適宜的pH值也不同，應(yīng)該根據(jù)所培養(yǎng)的植物特性來確定pH值，多數(shù)植物要求滅菌前培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)到5.7~5.8。經(jīng)高溫高壓滅菌后，培養(yǎng)基的pH值會(huì)下降0.2~0.8個(gè)單位，故滅菌前的pH值要高于目標(biāo)pH值0.5個(gè)單位。

植物組培中材料培養(yǎng)的條件

接種后的外植體應(yīng)轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件要根據(jù)植物對(duì)環(huán)境條件的不同需求進(jìn)行調(diào)控。培養(yǎng)室控制的條件主要有溫度、光照、濕度和氣體。

溫度

溫度是植物組織培養(yǎng)中的重要因素，在適宜的溫度下植物才能良好的生長、分化。多數(shù)植物適宜生長溫度是在20~30℃，低于15℃時(shí)生長停止，高于35℃會(huì)抑制正常生長和發(fā)育。一個(gè)培養(yǎng)室內(nèi)往往培養(yǎng)著許多種植物，為適合大多數(shù)植物生長，培養(yǎng)室的溫度一般設(shè)定在（25±2）℃。

因?yàn)橹参镌谧匀唤缰虚L期進(jìn)化，所以不同的植物對(duì)環(huán)境溫度的要求各有差別。一般生長在高寒地區(qū)的植物，其最適生長溫度較低；而生長在熱帶地區(qū)的植物，則對(duì)環(huán)境溫度相對(duì)要求較高。如馬鈴薯在20℃情況下培養(yǎng)效果較好，菠蘿在28-30℃情況下培養(yǎng)效果較好。在條件允許的情況下，可設(shè)立多個(gè)小培養(yǎng)室，根據(jù)不同植物對(duì)環(huán)境溫度的要求來設(shè)定培養(yǎng)室溫度。同時(shí)，也可根據(jù)培養(yǎng)室內(nèi)上下層架的溫差來調(diào)節(jié)，一般培養(yǎng)室內(nèi)最上層與最下層的溫差為2-3℃。

光照

光是植物進(jìn)行光合作用必不可少的條件之一，對(duì)離體培養(yǎng)物的生長發(fā)育具有重要的作用。光照的影響主要表現(xiàn)在光照強(qiáng)度、光照時(shí)間和光質(zhì)三個(gè)方面。

（1）光照強(qiáng)度

對(duì)多數(shù)植物來說，1000~4000ulx的光強(qiáng)即能滿足其生長的需要。器官的分化需要光照，并隨著試管苗的生長，光照強(qiáng)度需要不斷地加強(qiáng)，才能使小苗生長健壯，并促進(jìn)它從“異養(yǎng)”向“自養(yǎng)”轉(zhuǎn)化，以提高移植后的成活率。通常在初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)階段，1000~2500lux即可滿足要求。而對(duì)于生根壯苗階段，宜提高到3000~3500lux甚至10000lux。光照強(qiáng)度強(qiáng)，幼苗生長得粗壯，而光照強(qiáng)度弱，幼苗容易徒長。

對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)來說，暗培養(yǎng)比光培養(yǎng)更合適，可用鋁箔或者適合的黑色材料包裹在容器的周圍，或置于暗室中培養(yǎng)。另外，在有些植物組織培養(yǎng)中，光的存在有時(shí)會(huì)抑制根的形成，這時(shí)可以在培養(yǎng)基中加入活性炭，提高根的形成率。

（2）光照時(shí)間
普通培養(yǎng)室要求每日光照12~16h。生產(chǎn)中，在不影響材料正常生長的條件下，盡量縮短光照時(shí)間，減少能源消耗，降低生產(chǎn)成本。在進(jìn)行葡萄莖段培養(yǎng)時(shí)，對(duì)日照敏感的品種只有在短日照條件下才能形成根，而對(duì)日照長度不敏感的品種在任何條件下培養(yǎng)均可以形成根。
（3）光質(zhì)
光質(zhì)對(duì)細(xì)胞分裂和器官分化也有很大影響。如在香石竹的培養(yǎng)中，藍(lán)光有利于誘導(dǎo)側(cè)芽產(chǎn)生，還有利于蛋白質(zhì)含量的增加；紅光可以促進(jìn)芽增長，并且生長整齊。白光有利于試管苗的生長發(fā)育，生物產(chǎn)量最高；紅光次之；藍(lán)光促進(jìn)提高莖葉中的還原糖含量，但對(duì)總糖的影響不大；白光還能增加葉綠素的合成。在唐菖蒲的子球切塊培養(yǎng)中，在藍(lán)光下出苗比在白光和紅光下早，且幼苗生長旺盛，根系粗壯；白光下幼苗纖細(xì)；紅光下出苗量少。而紅光對(duì)百合和四季豆愈傷組織的誘導(dǎo)和生長比在白光下好。光質(zhì)對(duì)植物組織分化的影響，目前尚無一定規(guī)律可循，這可能是不同植物對(duì)光信號(hào)反應(yīng)不同所致。但如果能把這些光質(zhì)的作用，有意識(shí)地運(yùn)用到種苗的規(guī)模化生產(chǎn)中，可達(dá)到節(jié)省能源，提高產(chǎn)量的目的。

濕度

組織培養(yǎng)中的濕度影響主要有培養(yǎng)容器內(nèi)濕度和培養(yǎng)環(huán)境濕度兩方面。

容器內(nèi)的濕度可保持在100%，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，相對(duì)濕度也會(huì)有所下降。容器內(nèi)的濕度主要受瓊脂含量和封口材料的影響。在冬季應(yīng)適當(dāng)減少瓊脂用量，否則，將使培養(yǎng)基干硬，不利于外植物體接觸或插進(jìn)培養(yǎng)基，導(dǎo)致生長發(fā)育受阻。在培養(yǎng)容器封口材料選擇上應(yīng)十分注意，所選擇的封口材料至少要保證在一個(gè)月內(nèi)有充足水分來滿足外植體的需要。如果培養(yǎng)容器內(nèi)水分散失過多，培養(yǎng)基滲透壓升高，會(huì)阻礙培養(yǎng)物的生長和分化。當(dāng)然，封口材料過于密閉，影響氣體交流，導(dǎo)致有害氣體難于散去，也會(huì)影響培養(yǎng)物的生長和分化。

環(huán)境濕度變化隨季節(jié)和大氣而有很大變動(dòng)。濕度過高或過低對(duì)培養(yǎng)材料的生長都是不利的，過低會(huì)造成培養(yǎng)基失去而干枯，影響培養(yǎng)物的生長和分化；濕度過高會(huì)造成雜菌滋生，導(dǎo)致大量污染。培養(yǎng)室的相對(duì)濕度一般要保持在70%~80%，濕度過高時(shí)可用除濕機(jī)降濕，過低時(shí)可采用加濕機(jī)加濕、噴水或拖地來增濕。

氣體環(huán)境

植物組織培養(yǎng)中，植物的呼吸需要氧氣。在液體培養(yǎng)中，需進(jìn)行振蕩和旋轉(zhuǎn)或淺層培養(yǎng)以解決氧氣供應(yīng)。在固體培養(yǎng)中，接種時(shí)不要把培養(yǎng)物全部埋入培養(yǎng)基中，以避免氧氣不足，剛剛切割后的外植體會(huì)產(chǎn)生乙烯，造成材料的老化，從而影響生長和分化。另外，培養(yǎng)物產(chǎn)生二氧化碳，當(dāng)濃度過高時(shí)，會(huì)阻礙培養(yǎng)物的生長和分化。因此要注意瓶?jī)?nèi)與外界保持通氣狀態(tài)，最好采用通氣性好的瓶蓋、有濾氣膜的封口材料或棉塞。培養(yǎng)室要適當(dāng)通風(fēng)換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況，每次通風(fēng)后要進(jìn)行一次消毒，避免引起培養(yǎng)污染。

一個(gè)完整的植物組織培養(yǎng)過程包括的步驟:

準(zhǔn)備階段

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)已成功培養(yǎng)的相近植物資料，結(jié)合實(shí)際制訂出切實(shí)可行的培養(yǎng)方案。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案配制適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)消毒劑以及不同培養(yǎng)階段所需的培養(yǎng)基，并經(jīng)高壓滅菌或過濾除菌后備用。

外植體選擇與消毒

選擇合適的部位作為外植體，采回后經(jīng)過適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，然后進(jìn)行消毒處理。將消毒后的外植體在無菌條件下切割成一定大小的小塊，或剝離出莖尖，挑出花藥，接種到初代培養(yǎng)基上。

初代培養(yǎng)

接種后的材料置于培養(yǎng)室或光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，促使外植體中已分化的細(xì)胞脫分化形成愈傷組織，或頂芽、腋芽直接萌發(fā)形成芽。然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基分化成不同的器官原基或形成胚狀體，最后發(fā)育形成再生植株。

繼代培養(yǎng)

分化形成的芽、原球莖數(shù)量有限，采用適當(dāng)?shù)睦^代培養(yǎng)基經(jīng)多次切割轉(zhuǎn)接。當(dāng)芽苗繁殖到一定數(shù)量后，再將一部分用于壯苗生根，另一部分保存或繼續(xù)擴(kuò)繁。進(jìn)行脫毒苗培養(yǎng)的需提前進(jìn)行病毒檢測(cè)。

生根培養(yǎng)

剛形成的芽苗往往比較弱小，多數(shù)無根，此時(shí)可降低細(xì)胞分裂素濃度或不添加，提高生長素濃度，促進(jìn)小苗生根，提高其健壯度。

煉苗移栽

選擇生長健壯的生根苗進(jìn)行室外煉苗，待苗適應(yīng)外部環(huán)境后，再移栽到疏松透氣的基質(zhì)中，注意保溫、保濕、遮蔭，防止病蟲危害。當(dāng)組培苗完全成活并生長一定大小后，即可移向大田用于生產(chǎn)。