1 葡萄組織培養(yǎng)的研究與應(yīng)用

  1.1 葡萄組培研究簡(jiǎn)史

  世界上關(guān)于葡萄組織培養(yǎng)快速繁殖體系建立工作已取得了跨越式的進(jìn)展，利用葡萄的葉片、葉柄、單芽莖段等外植體，通過器官發(fā)生途徑獲得了再生植株 ;利用葡萄的葉片、莖段等外植體及原生質(zhì)體，通過體胚發(fā)生方式獲得了完整植株，快速形成無性繁殖體系。

  1.2 應(yīng)用前景及意義

  快速擴(kuò)繁經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高或者稀有的植物品種，受到區(qū)域、季節(jié)變化的局限，很難達(dá)到快繁的目的;尤其是在短時(shí)間內(nèi)需要達(dá)到一定數(shù)量，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的植物，則需要通過組織離體培養(yǎng)的方法才可以實(shí)現(xiàn)。組培作為新興技術(shù),已經(jīng)廣泛應(yīng)用于葡萄育種、葡萄種質(zhì)資源保存、葡萄生產(chǎn)等方面。近年來，新疆黑提葡萄發(fā)展非常迅速，對(duì)壯大新疆林果經(jīng)濟(jì)和提升百姓生活質(zhì)量水平起到了巨大的推動(dòng)作用。對(duì)葡萄品種的選育和引進(jìn)，可在短時(shí)間內(nèi)提供大量?jī)?yōu)良種苗木，達(dá)到生產(chǎn)的需求。

  2 外植體的剪取、消毒

  2.1 外植體的剪取

  外植體剪取以春季和秋季為宜，選擇地上部分生命力旺盛的枝條莖段作為外植體，避免選擇在陰雨天剪取，晴天待露水曬干后剪取，剪取前噴施殺蟲劑和殺菌劑。將采回的黑提葡萄莖段(半木質(zhì)化，附帶腋芽)用自來水沖洗3～5次，剪去病、蟲、長(zhǎng)勢(shì)弱枝和大葉片后再剪成2～3 cm Y字小型莖段，放入干燥滅菌的廣口瓶中，加入洗潔精清洗后將洗潔精沖洗干凈，后用蒸餾水沖洗2～3遍。

  2.2 外植體的消毒

  在超凈工作臺(tái)上倒入無菌水浸泡并沖洗1次，緩慢倒出無菌水加入75%酒精浸泡7～8 s，快速倒出酒精以免損壞外植體，再使用無菌水沖洗2遍后加入0.1%升汞浸泡，放置7 min左右倒出，使用無菌水沖洗3～4次，取出高壓蒸汽滅菌的濾紙，將莖段放在濾紙上吸干水分，使用無菌剪剪去褐變枝端。外植體莖段消毒滅菌過程務(wù)必在超凈工作臺(tái)(無菌)進(jìn)行操作。

  3 培養(yǎng)基的配方及制備

  3.1 培養(yǎng)基的成分

  離體組織培養(yǎng)期間，培養(yǎng)基能提供外植體生長(zhǎng)主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子。

  3.1.1 無機(jī)營(yíng)養(yǎng)物

  13種植物生長(zhǎng)的必需的元素，即磷(P)、氮(N)、鈣(Ca)、鉀(K)、鎂(Mg)、鋅(Zn)、鉬(MO)、氯(Cl)、硫(S)、鐵(Fe)、硼(B)、錳(Mn)和銅(Cu)，在培養(yǎng)基中加入的鹽類中全部含有。

  3.1.2 有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物

  有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物主要有2類，其中：有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可為植物細(xì)胞提供碳、氫、氧、氮等必需元素，如糖類、氨基酸及酰胺類;生理活性物質(zhì)在植物的代謝過程中可起到一定的作用，如煙酸和肌醇等。

  3.1.3 植物生長(zhǎng)激素

  植物生長(zhǎng)激素包括人工合成生長(zhǎng)激素物質(zhì)以及植物天然的5類激素物質(zhì)，其中，常用生長(zhǎng)素有萘乙酸和吲哚乙酸，常用的細(xì)胞分裂素有6-芐基氨基嘌呤，常用的赤霉素類物質(zhì)，常用的乙烯類物質(zhì)有乙烯利和乙烯。

  3.1.4 其他附加物

  其他附加物成分對(duì)植物細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但不是植物細(xì)胞生長(zhǎng)所必需。

  固體培養(yǎng)基的必需成分為瓊脂，為降低組織培養(yǎng)物的有害代謝物濃度，可以加入適量的活性炭，以利于植物細(xì)胞生長(zhǎng);在快繁進(jìn)程中由菌類污染造成成百上千組培苗損失的現(xiàn)象較為普遍，適當(dāng)加入抗生素不僅能挽回大量培養(yǎng)物，而且也能節(jié)約大量的物力、時(shí)間及人力。

  3.2 培養(yǎng)基的選定

  不同植物體的不同生長(zhǎng)階段所需的培養(yǎng)基種類不同，需針對(duì)不同階段進(jìn)行選擇。組培培養(yǎng)使用較廣泛的培養(yǎng)基主要有MS培養(yǎng)基、NN培養(yǎng)基及BR培養(yǎng)基等。其中，MS培養(yǎng)基主要作用于愈傷組織誘導(dǎo)組織分化等階段，葡萄組培常用MS培養(yǎng)基。

  3.3 培養(yǎng)基的制備

  3.3.1 MS培養(yǎng)基母液的制備

  3.3.1.1 母液A(大量元素)

  使用電子天平稱取KNO3(19g)、NH4NO3(16.5g)、MgSO·4H2O(3.7 g)、KH2PO4(1.7 g)、CaCl·22H2O(4.4 g)放入不同燒杯。燒杯中加入少量蒸餾水?dāng)嚢杈鶆蚴顾幤烦浞秩芙?，再依次倒入容量瓶加蒸餾水定容至1 000 mL，充分搖勻。

  3.3.1.2 母液B(微量元素)

  使用電子天平稱取NaMoO4·2H2O(0.012 5 g)、H3BO3(0.31 g)、CuSO4·5H2O(0.001 25 g)、MnSO4·4H2O(1.115 g)、CoCL2·6H2O(0.001 25 g)、KI(0.041 5 g)、ZnSO4·7H2O(0.43 g)放入不同燒杯。 燒杯中加入少量蒸餾水?dāng)嚢杈鶆蚴顾幤烦浞秩芙?，再依次倒入容量瓶加蒸餾水定容至1 000 mL，充分搖勻。

  3.3.1.3 母液C(鐵鹽)

  使 用 電 子 天 平 稱 量FeSO4·7H2O(1.39 g)、Na2EDTA(1.85 g)，放入不同燒杯。燒杯中加入少量蒸餾水?dāng)嚢杈鶆蚴顾幤烦浞秩芙?，再依次倒入容量瓶加蒸餾水定容至500 mL，充分搖勻。

  3.3.1.4 母液D(有機(jī)附加物質(zhì))

  使用電子天平稱量煙酸(0.025 g)、肌醇(5.0 g)、VB1(0.005 g)、VB6(0.025 g)、甘氨酸(0.1 g)，放入不同燒杯。燒杯中加入少量蒸餾水用玻璃棒攪勻使藥品充分溶解，再依次倒入容量瓶加蒸餾水定容至500 mL，充分搖勻。

  3.3.2 激素的配制

  6BA(0.5mg/mL)、IBA(0.5mg/mL)、NAA(0.5mg/mL)，使用0.1mol/LNaOH或少量95%的酒精溶解。

  3.3.3 MS培養(yǎng)基的熬制

  在1 L水中加瓊脂6 g，糖30 g(水燒至沸騰后先加瓊脂再放糖)，全部溶解后攪拌均勻再次定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至5.8～6.4。

  3.3.4 培養(yǎng)基的分裝

  按照使用的目的和要求將培養(yǎng)基倒入規(guī)定的容器中，容器應(yīng)當(dāng)有一定的密閉性和透氣性，并且方便高壓蒸汽滅菌，適合植物生長(zhǎng)。

  3.3.5 培養(yǎng)基的滅菌

  瓶裝培養(yǎng)基在121℃的溫度下進(jìn)行高壓蒸汽滅菌15 min。

  3.3.6 培養(yǎng)基的存放

  制備好的瓶裝培養(yǎng)基應(yīng)置于陰暗、低溫處存放，并標(biāo)注培養(yǎng)基類型編號(hào)以免混淆，宜盡早使用。

4 愈傷組織和瓶苗的培養(yǎng)

  外植體培養(yǎng)2周左右會(huì)出現(xiàn)愈傷組織，應(yīng)關(guān)閉燈光或遮光處理，在黑暗條件下愈傷組織生長(zhǎng)速度更快，培養(yǎng)基養(yǎng)分耗盡必須更換培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng);繼代培養(yǎng)過程中應(yīng)選擇不同的生長(zhǎng)激素來調(diào)劑不同部位的生長(zhǎng)情況：黑提葡萄莖尖愈傷誘導(dǎo)適培養(yǎng)基為IBA 0.10 mg/L+1/2MS+6BA 1.0 mg/L，莖葉分化以IBA 0.10 mg/L+l/2MS+6BA 1.5 mg/L為宜，生根培養(yǎng)以IBA 1.0 mg/L+1/2MS為宜，黑提葡萄組織快繁中使用激素濃度不可過高。

  5 瓶苗的移栽和鍛煉

  當(dāng)黑提葡萄瓶苗生長(zhǎng)至大量粗壯根系、有5～8片葉、高4～8 cm時(shí)，則將黑提葡萄瓶苗轉(zhuǎn)移至室內(nèi)自然光下鍛煉3 d，使其適應(yīng)溫室室內(nèi)環(huán)境，再將組培苗瓶蓋打開一半，在溫室內(nèi)練苗2 d，然后將瓶蓋全部打開1 d。從培養(yǎng)瓶中取出小苗，用清水洗掉根部附著的培養(yǎng)基，以免帶入蛭石導(dǎo)致根腐，移栽前將瓶苗根部快速蘸取低濃度生根劑和多菌靈后移栽于營(yíng)養(yǎng)缽中，澆水浸透后覆蓋薄膜或搭建拱棚保濕，每2～3 h用噴壺噴1次葉面水(可加少量生根劑);培養(yǎng)環(huán)境為20～25℃的溫室條件下，基質(zhì)溫度高于氣溫溫度佳。經(jīng)過15 d后，黑提葡萄葉片轉(zhuǎn)綠增大，出現(xiàn)3～5片新綠嫩葉，新發(fā)出白色側(cè)根時(shí)移入苗床栽植，30 d后葉片逐漸增大，慢慢木質(zhì)化，成活率達(dá)95%以上，便可轉(zhuǎn)入常規(guī)栽培管理。