1 材料與方法

  1.1 無菌體系的建立

  材料為多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua，取福建農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物中心收集的野生多花黃精資源，剝?nèi)а扛o，剝離葉包片，流水沖洗2 h，分不同消毒時(shí)間和消毒劑量處理，經(jīng)表面消毒后，切成0.5 cm長(zhǎng)的莖尖組織接種到MS培養(yǎng)基中，25±1 ℃，遮光處理。

  1.2 多花黃精莖尖誘導(dǎo)分化

  將沒有污染的多花黃精外植體轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，25±1 ℃，光照1 500 Lx，時(shí)間10 h。

  1.3 BA對(duì)多花黃精增殖系數(shù)的影響

  將誘導(dǎo)分化的多花黃精莖尖從誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到不同BA激素組合的繼代與增殖的培養(yǎng)基中，確定佳的BA濃度，25±1 ℃，光照1 500 Lx，時(shí)間10 h。

  2 結(jié)果與分析

  2.1 不同消毒組合對(duì)無菌苗建立的影響

  為了確定多花黃精莖尖無菌苗建立佳的消毒方式和消毒時(shí)間，因兩種不同濃度的HgCl2和消毒時(shí)間設(shè)置了8種消毒組合，重復(fù)三次。接種30 d后，觀察統(tǒng)計(jì)污染個(gè)數(shù)、萌芽個(gè)數(shù)、死亡個(gè)數(shù)(見表1)。從表中可以發(fā)現(xiàn)0.1%HgCl2浸泡5 min污染率高，高達(dá)85%，沒有得到滿意效果，隨消毒時(shí)間增加污染率明顯下降，達(dá)到30%，表明消毒時(shí)間過短不利于外植體的存活。在20 min消毒時(shí)間下，多花黃精污染率還是偏高，這表明一般情況下的0.1%HgCl2不能滿足其消毒，故選擇加大濃度用0.2%HgCl2來提高外植體的成活率。對(duì)比兩種濃度，在0.2%HgCl2下污染率明顯下降，在20 min時(shí)污染率低，此時(shí)存活率卻不是高，因?yàn)楦邼舛乳L(zhǎng)時(shí)間的消毒，對(duì)外植體的毒害作用強(qiáng);在15 min時(shí)，污染率低存活率高，滿足多花黃精的外植體消毒，達(dá)到兩者之間的一個(gè)平衡。

  表1 不同消毒組合對(duì)無菌苗建立的影響

  注：污染率=污染的個(gè)數(shù)/接種的總個(gè)數(shù)×100%，存活率=存活個(gè)數(shù)/接種的總個(gè)數(shù)×100%

  2.2 不同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)多花黃精分化的影響

  為確定更適合多花黃精分化的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，比較了BA，IBA，KT在濃度10 mg·L-1時(shí)的分化率，其中保持NAA濃度在0.2 mg·L-1，設(shè)計(jì)了表2的試驗(yàn)方案，每組合接種20個(gè)，30 d后觀察統(tǒng)計(jì)，重復(fù)三次試驗(yàn)。

  表2 不同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)多花黃精分化的影響

分化率=分化個(gè)數(shù)/接種個(gè)數(shù)*100%

  從表2中可以看出，在這幾種培養(yǎng)基中，添加了BA的分化率明顯比未加BA分化率高，其分化率分別達(dá)到：85%，80%，75%，其他兩種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑所產(chǎn)生的分化率要低于BA所達(dá)到的分化率。多花黃精所分化的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑要明顯高于其他的材料，需要高濃度，這與其他研究者發(fā)現(xiàn)不同。需要高濃度的外源激素來刺激多花黃精的分化，通過高滲透來提高其分化，這將為下一步的研究作出明確方向。見圖1。

  圖1 多花黃精的誘導(dǎo)分化

  2.3 BA對(duì)多花黃精叢生芽增殖系數(shù)的影響

  通過對(duì)多花黃精分化的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑選擇可以看出BA對(duì)多花黃精分化具有明顯的作用，在其增殖過程中著重考慮BA的影響，而初步試驗(yàn)中得到BA低濃度時(shí)多花黃精不能分化，因此采取高濃度的BA，故做了表3中的設(shè)計(jì)方案。每瓶接種1個(gè)芽，接種10瓶，一個(gè)月后統(tǒng)計(jì)叢生芽的個(gè)數(shù)，觀察統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)，重復(fù)三次。

  表3 BA對(duì)多花黃精增殖系數(shù)的影響

  增殖系數(shù)=繼代時(shí)叢生芽個(gè)數(shù)/接種時(shí)叢生芽個(gè)數(shù)

  從表3中可以看出，BA濃度在10 mg·L-1～60 mg·L-1范圍內(nèi)，高濃度的BA均能有較好誘導(dǎo)增殖，BA濃度為40 mg·L-1達(dá)到佳，增殖系數(shù)達(dá)到2.8，在BA濃度為60 mg·L-1時(shí)增殖系數(shù)低，為1.6，相對(duì)也有不錯(cuò)的增殖率。在一定高濃度范圍內(nèi)，隨著BA濃度的提高，莖尖增殖系數(shù)隨著增加，BA濃度增至40 mg·L-1時(shí)，增殖系數(shù)大。從表現(xiàn)性狀上看，高濃度的BA對(duì)多花黃精芽分化起著很重要的作用。為何需要如此高濃度，其中機(jī)理需要進(jìn)一步的研究。見圖2。

  圖2 BA對(duì)多花黃精增殖的影響

  3 討論

  在多花黃精離體培養(yǎng)初步研究過程中發(fā)現(xiàn)，福建多花黃精的無菌體系建立存在困難，在10 d后還會(huì)出現(xiàn)內(nèi)生菌，這給外植體消毒帶來難度，高濃度長(zhǎng)時(shí)間消毒不利于外植體的存活，過低時(shí)又不能得到高存活率。究其原因，可能是因?yàn)椴牧先≡从谝吧N源，在材料本身中存在著內(nèi)生菌。另外，消毒過程中的切割也得，避免其所產(chǎn)生的黏液。

  在多花黃精增殖過程中，高濃度的BA會(huì)提高多花黃精的增殖系數(shù)，這個(gè)與已見報(bào)道的不一樣，通過莖尖切片在低濃度的BA和2，4-D作用下誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織分化后產(chǎn)生新植株。本文采取的是高濃度直接在塊根上刺激潛伏芽重新分化成新的植株，經(jīng)初步試驗(yàn)中低濃度對(duì)潛伏芽重新萌芽作用不大，高濃度的BA有利于潛伏芽的分化，可以在栽培過程中進(jìn)行前處理，有可能擴(kuò)大多花黃精栽培萌芽率。目前在探索如何降低高濃度的BA，以期能夠在快速繁殖過程中得到擴(kuò)繁，有益于工廠化生產(chǎn)。