木本植物組織培養(yǎng)中的關鍵因素

文章作者：騰昊科技發(fā)布時間：2021-09-07 15:57:49 瀏覽次數(shù)：8575次

一、基本培養(yǎng)基

在對植物進行組織培養(yǎng)研究時，首先需考慮培養(yǎng)基選擇的問題，而基本培養(yǎng)基的選擇是在研究中優(yōu)先被考慮?，F(xiàn)今，依照基本培養(yǎng)基的成分與元素的濃度，大致分為4個類型：富集元素平衡培養(yǎng)基(包括 MS、LS、BL、ER等)，高硝酸鉀含量培養(yǎng)基(包括 B5、N6、SH等)，中等無機鹽含量的培養(yǎng)基(包括 H、Nitsch、Miller等)和低無機鹽培養(yǎng)基(包括White、WS、HE等) 。在絕大多數(shù)的植物組織培養(yǎng)中，通常選擇MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，但也需要參照目標植物的近緣物種的相關研究成果進行選擇基本培養(yǎng)基。不過，在一般情況下，植物能夠適應多種基本培養(yǎng)基，但不同的誘導培養(yǎng)目的，選擇最佳的基本培養(yǎng)基不同。

在對麻瘋樹的組織培養(yǎng)研究中，以幼胚為外植體，去除胚乳，接種MS、LM、WPM、N6 4種未添加任何植物激素的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)N6早生出胚根，而MS與WPM能夠大量誘導出愈傷組織，并且WPM培養(yǎng)基上的分化不定芽數(shù)量最多，在不定芽生根中，以LM與WPM培養(yǎng)基的生根誘導率最高，不過WPM培養(yǎng)基上的主根較少，側(cè)根系發(fā)達，因此WPM培養(yǎng)基是最佳培養(yǎng)基。雖然基本培養(yǎng)基在植物組織培養(yǎng)中起到支撐作用，但各種培養(yǎng)基都包含了植物生長所需的基本元素，只是其濃度比例不一，并且在實際培養(yǎng)中仍需添加激素、抗氧化劑或一些物質(zhì)進行補充，使得培養(yǎng)效果達到最佳。

二、植物激素

在1905年德國植物學家Haberlandt提出植物細胞具有全能性的概念時，植物組織培養(yǎng)技術就已經(jīng)開始發(fā)展，不過其技術發(fā)展歷程十分艱辛與緩慢，很大的原因是當時尚未發(fā)現(xiàn)對植物細胞生長分化起著促進作用，但其濃度很低的物質(zhì)，后來這類物質(zhì)被稱為植物激素。目前，天然植物激素因其主要的調(diào)控作用，被分為5類：生長素、細胞分裂素、赤霉素、乙烯和脫落酸。由于天然植物激素在植物體內(nèi)含量極微，因此想從天然來源提取激素十分困難且不經(jīng)濟。在了解天然植物激素化學結構后，現(xiàn)如今已經(jīng)可以大量人工合成植物激素，并對原有結構進行改變，制成活性更強的植物激素類似物，如常用的2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)與KT(激動素)等物質(zhì)。自植物激素運用以來，植物組織培養(yǎng)技術不斷實現(xiàn)對不同品種植物的離體再生，獲得完整植株。

1 生長素

生長素是最早被發(fā)現(xiàn)的一類植物內(nèi)源激素，參與了植物根和莖的發(fā)育、器官的衰老與維管束組織的形成等方面的植物生長分化過程。在植物組織培養(yǎng)研究中，常用的生長素主要包括IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、NAA、2，4-D，其中以2，4-D的活性最強，濃度過高，易引起遺傳變異。并且過高的生長素濃度會對木本植物誘導芽增殖起到抑制作用。

在對不同生長素影響喜樹組培苗生根的研究中發(fā)現(xiàn)，IBA比NAA對誘導生根效果要好，但兩者濃度過高都會對生根造成抑制效果，最佳的濃度為IBA 0.5 mg/L。而在對紅松的組織培養(yǎng)研究中，也獲得了相似的結果，在生長素類激素含量較高時發(fā)生不定根。在對棗樹愈傷組織形成的不定芽進行不定根誘導的研究中發(fā)現(xiàn)，IBA效果最好 ,其次是 IAA,NAA生根率低，并且仍會有大量愈傷組織生成，而2，4-D主要以愈傷組織誘導為主。

2 細胞分裂素

細胞分裂素是在組織培養(yǎng)中另一種重要的植物內(nèi)源激素，通常與生長素一起使用，兩者相輔相成，能夠達到更好的培養(yǎng)效果。細胞分裂素大致可分成兩類,一類是嘌呤型細胞分裂素(CTK),另一類是苯基脲型細胞分裂素(PUD)。植物組織培養(yǎng)中常用的第一類嘌呤型細胞分裂素，包括BA(芐基腺嘌呤,又稱 6-BA,BAP)，KT(激動素,KIT,KIN)，2IP(2-異戊烯基腺嘌呤)，ZEA(玉米素,即異戊二烯腺嘌呤,又稱ZT)。苯基脲型細胞分裂素是新型的細胞分裂素，其中TDZ(噻苯隆)是人工合成的一種植物激素，因具有高度的細胞分裂素活性，也常被使用。在對紅松和棗樹的組織培養(yǎng)研究中，發(fā)現(xiàn)細胞分裂素BA對誘導不定芽的效果較好，不過BA會抑制不定根的產(chǎn)生。在防止酸櫻桃組培苗玻璃化的研究中，發(fā)現(xiàn)BA會提高玻璃化率，而KT對玻璃化無影響。在探討TDZ對于木本植物組織培養(yǎng)中的影響認為，TDZ能夠促進許多再生困難的木本植物品種完成微繁殖過程，在濃度低于1 μmol/L時，能夠使腋芽增殖，但可能抑制芽的伸長;在濃度高于1 μmol/L時，能夠刺激愈傷組織的形成、誘導叢生芽與體細胞胚發(fā)生。

3 赤霉素

赤霉素至今已發(fā)現(xiàn)100多種，總稱為赤霉素類(GAs)。其中只有少數(shù)赤霉素對植物的生長發(fā)育具有生物活性，在木本組織培養(yǎng)的研究中應用較多的是GA3。GA3的作用類似于生長素，但與其不同的是，GA3對完整植株的作用要強于對離體器官或組織的作用。GA3可刺激器官的生長，卻抑制器官的發(fā)生，如GA3對不定根的產(chǎn)生具有抑制作用，但在根原基形成以后，則不對不定根的發(fā)生造成影響。

在對龍眼和荔枝的組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，GA3對兩者的愈傷組織誘導具有抑制作用，應該省去不用。在對白木香組織培養(yǎng)技術及植株再生的研究中發(fā)現(xiàn)，GA3僅對種子萌發(fā)具有促進作用，其余誘導器官發(fā)生的部分都不宜使用。而在對于美國月桂櫻組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，GA3對芽的伸長沒有效果。據(jù)相關報道，赤霉素能促進植物開花，但對于植物離體再生作用較小，尚沒有廣泛運用。

4 乙烯

乙烯是一種氣態(tài)的植物激素，廣泛存在于植物成熟的果實果皮中，對催化果實成熟有促進作用。而乙烯對于植物組織培養(yǎng)作用方面的研究尚少。都對乙烯在愈傷組織誘導、體細胞胚發(fā)生、不定芽與不定根的誘導等相關研究進行了概述，表明了乙烯在不同植物品種中具有起到的作用不一，而在木本組織培養(yǎng)中，乙烯的作用很少涉及。謝耀堅在對歐洲云杉胚性愈傷組織培養(yǎng)中乙烯的釋放及其作用的研究中，發(fā)現(xiàn)乙烯釋放量的變化對胚性愈傷組織的誘導率無明顯促進或抑制作用。乙烯在木本植物組織培養(yǎng)方面的作用仍需進一步研究。

5 脫落酸

脫落酸作為五大類激素之一，對植物細胞分裂擴增起著重要調(diào)控作用，而且經(jīng)常在組織培養(yǎng)方面，通過提高愈傷組織的干燥耐受性和防止提早發(fā)芽，從而促進體細胞胚的發(fā)生與提高體細胞胚的質(zhì)量。脫落酸不只調(diào)節(jié)植物細胞的生長發(fā)育，還在植物細胞受到脅迫時發(fā)揮作用。因此，脫落酸以其在植物生長發(fā)育中所起的獨特作用，近年來不斷受到科學家的青睞，研究深度與廣度逐步增加。

進行了脫落酸對棕櫚樹體細胞胚發(fā)生的影響研究，發(fā)現(xiàn)添加0.1 mg/L脫落酸時，促進的體細胞胚發(fā)生量最大，濃度過高則會減少體細胞胚的發(fā)生量。同樣以棕櫚樹為研究對象，發(fā)現(xiàn)運用懸浮培養(yǎng)方式，與添加50～100μmol/L的脫落酸濃度對同步化誘導體細胞胚具有促進作用。在利用未成熟的椰子種子為外植體，進行愈傷組織誘導后，以添加7.5 μmol/L的脫落酸濃度，體細胞胚發(fā)生量最大，但無法進一步萌發(fā)出芽，而5～5 μmol/L的ABA濃度，可以成功生出芽。

三、碳源

在對植物細胞進行組織培養(yǎng)時，除了需要添加植物激素，與基本培養(yǎng)基所提供的基本營養(yǎng)元素外，生長發(fā)育主要所需的能量物質(zhì)是由碳源物質(zhì)所提供的。碳源一般是糖類物質(zhì)，常用的碳源物質(zhì)有蔗糖、葡萄糖、果糖與半乳糖等。其中蔗糖與果糖，在植物組織培養(yǎng)中最為廣泛運用。碳源不只是為植物細胞提供能量物質(zhì)，還能為植物細胞提供滲透壓，提供細胞吸取養(yǎng)分的動力，而滲透壓與碳源的種類與濃度密切相關。

蔗糖是植物組織培養(yǎng)中，最常用的碳源物質(zhì)，屬于非還原性二糖。蔗糖在供能外，還能促進愈傷組織的再分化。由于植物細胞對蔗糖的吸收速率較慢，因此蔗糖能夠長期保持較穩(wěn)定的滲透壓，為植物細胞生長發(fā)育提供穩(wěn)定的環(huán)境。而且蔗糖一般不能被微生物直接利用，對微生物的污染有一定程度的減輕效果。

利用不同碳源對桑樹莖尖進行培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)果糖是桑樹誘導芽尖與繼代培養(yǎng)效果最佳的碳源，而葡萄糖可在繼代培養(yǎng)中替代果糖，達到更好的培養(yǎng)效果。利用不同碳源對獼猴桃的組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，蔗糖和葡萄糖對芽的分化效應無明顯差異，不過低濃度的碳源不能很好地進行芽分化和生長，而高濃度的碳源雖能較好地誘導芽分化，但抑制了后期芽的生長。在植物組織培養(yǎng)中，一般多用蔗糖作為培養(yǎng)基碳源，對于個別植物的組織培養(yǎng)則以葡萄糖與果糖這些單糖作為碳源更佳。因此，對植物組織培養(yǎng)中碳源種類與濃度的選擇也是必不可少的關鍵環(huán)節(jié)。

四、pH值

pH值在植物組織培養(yǎng)研究中，通常代表著培養(yǎng)基中的酸堿度。大多數(shù)植物在離體培養(yǎng)中，pH值的要求5.0～6.2。適宜的pH值，是植物組織離體再生過程中能夠正常吸取生長養(yǎng)分的重要影響因素。并且pH值能夠影響培養(yǎng)基的凝固程度，當pH較低(≤4.0)時，加入一定量的凝固劑，培養(yǎng)基都難于凝固。而培養(yǎng)基的凝固程度對培養(yǎng)物的支撐作用，對其保證正常生長發(fā)育具有重要意義。

在鈣離子與pH值對柚木組培苗生長和礦質(zhì)養(yǎng)分吸收影響的研究中發(fā)現(xiàn)，pH值對苗高生長及愈傷組織生物量積累有顯著影響，適宜pH值為6.0，只有穩(wěn)定在最適pH值上，增加鈣離子濃度，才會增加柚木組培苗的營養(yǎng)元素吸收。對3個越橘品種組培苗在pH值5～9條件下培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，不同越橘品種在相同pH值條件下生長狀況不一致。因此，表明pH值是影響植物組織培養(yǎng)的關鍵因素之一，而且不同植物品種的最適pH值都有所不同。